MODUL PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI (UJI ANTIBIOTIK)

Rabu, 31 Agustus 2022

UJI ANTIBIOTIK

Mikroba dapat disingkirkan, dihambat dengan atau dibunuh menggunakan bahan kimia dan faktor-faktor lain yang bersifat fisik seperti sinar matahari, logam, suhu dll. Bahan ini memegang peran penting dalam pengendalian mikroba. Bahan kimia dan fisika dapat dikelompokkan berdasarkan atas pengaruh yang ditimbulkan terhadap mikroba. Jika bahan tersebut menyebabkan hambatan atau penghentian pertumbuhan mikroba, bahan tersebut disebut mikrobiostatik, sedangkan bahan yang mematikan mikroba disebut mikrobiosidal.

Banyaknya senyawa baik senyawa organik maupun senyawa anorganik yang dapat membunuh mikroorganisme (antimikroba). Senyawa antimikroba ada yang termasuk kelompok antibiotika, desinfektan, dan antiseptik. Antibiotika adalah suatu substansi yang dihasilkan mikroorganisme yang dalam jumlah amat sedikit menunjukkan kegiatan antimikroba. Desinfektan adalah suatu zat kimia yang dapat mematikan sel vegetatif, tetapi belum tentu mematikan bentuk-bentuk spora mikroorgaisme. Antiseptik adalah suatu substansi untuk melawan infeksi atau mencegah pertumbuhan atau kerja mikroorganisme dengan cara menghancurkannya ataupun menghambat pertumbuhannya serta aktifitasnya. Istilah desinfektan dibedakan dari antiseptik dalam hal penggunaanya. Untuk desinfektan biasanya digunakan pada benda-benda atau materi tidak hidup, sedangkan antiseptik digunakan untuk jaringan hidup.

Dapat dilakukan evaluasi laboratoris terhadap efektifitas daya hambat zat-zat antimikroba (antibiotika, desinfektan, dan antiseptik), terhadap pertumbuhan mikroorganisme dengan berbagai cara:

a. Metode difusi atau cakram (‘disk method’)

Uji sensitifitas mikroba dengan metode difusi dapat digunakan untuk mengetahui jenis agensia kimia yang paling efektif menghambat atau membunuh mikrob pada kadar atau dosis tertentu. Metode difusi agar (Metode Kirby-Bauer) banyak digunakan untuk menentukan kepekaan suatu bahan antimikroba yang diisolasi dari proses infeksi. Cakram kertas yang telah diresapi antibiotika, desinfektan atau antiseptik diletakkan pada permukaan cawan yang telah diinokulasi dengan bakteri. Setelah diinkubasi dilakukan pengamatan terhadap adanya zona penghambatan (daerah jernih) di sekeliling cakram kertas. Ini menunjukkan organisme itu dihambat pertumbuhannya (sensitif) oleh senyawa antibiotika, desinfektan atau antiseptik yang merembes dari cakram kertas ke dalam agar. Apabila tidak terdapat zona penghambatan artinya bakteri tersebut resisten terhadap antibiotika, desinfektan, atau antiseptik. Resistensi bakteri adalah suatu sifat tidak terganggunya kehidupan sel bakteri oleh antimikrobia.

b. Metode dilusi atau dengan tabung (‘tube method’),

Metode ini dilakukan menggunakan 1 seri tabung reaksi yang diisi media cair dan jumlah zat tertentu sel mikroba yang di uji. Kemudian masing–masing tabung di isi dengan bahan yang telah di encerkan secara serial. Selanjutnya seri tabung di inkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 18-24 jam dan diamati terjadinya kekeruhan pada tabung. Konsentrasi yang rendah bahan pada tabung yang ditunjukan dengan hasil biakan yang mulai tampak jernih (tidak ada pertumbuhan mikroba) adalah KHM dari bahan uji. Konsentrasi terendah pada senyawa antimikroba pada biakan padat yang ditunjukan dengan tidak adanya pertumbuhan koloni mikroba adalah KBM dari bahan terhadap bakteri uji. Konsentrasi terendah dari antimikroba yang membunuh 99,9% inokulum bakteri disebut Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau Minimum Killing Concentration (MCK).

A. Uji Sensitivitas Bakteri Metode Difusi

Prinsip Kerja

Agensia kimia akan terdifusi ke dalam media agar yang dapat bersifat menghambat bakteri (bakteriostatis) atau membunuh bakteri (bakteriosida).

Bahan Pemeriksaan

Biakan bakteri murni/biakan standard

Isolat dari sampel (misal: sputum, urin, pus, feses)

Alat

Paper disc atau potongan kertas saring diameter 0,6 cm

Cotton buds/ Kapas lidi steril

Pinset

Beaker glass

Gelas ukur

Inkubator

Penggaris

Cawan petri steril

Bahan

Suspensi bakteri (Biakan murni bakteri dalam media nutrient cair yang berumur 24 jam)

Media Muller Hinton Agar

Aquadest steril

Desinfektan

Beberapa macam antibiotika konsentrasi 500 mg/10 ml = 50 mg/ml

Media nutrient cair

Cara kerja

1. Buat suspensi bakteri dengan menginokulasikan isolat pada media nutrient cair dan inkubasikan 37⁰C selama 4-6 jam. Kekeruhan suspense biakan dibuat setara dengan standart

2. Cairan media Muller Hinton Agar dalam waterbath lalu tuang dalam cawan petri steril dan biarkan padat dalam lempeng agar dengan ketebalan 4-5 mm

3. Inokulasikan suspensi biakan secara perataan pada permukaan lempeng agar menggunakan kapas lidi steril

4. Inkubasikan sebentar kira-kira 10 menit agar biakan terdifusi ke dalam media

5. Beri disk yang berisi agensia kimia pada permukaan lempeng agar tersebut menggunakan pinset steril. Atur jarak masing-masing disk kira-kira 15 mm

6. Inkubasi lempeng agar tersebut pada suhu 37 ⁰C selama 24 jam

7. Amati dan ukur diameter (zona) hambatan di sekitar disk. Tentukan zona hambatan tersebut yang termasuk resistant (R), atau intermediet (I), atau sensitive /susceptible (S) dengan dirujuk pada tabel.

LEMBARAN LAPORAN PRAKTIKUM

Nama :

NIM :

Tanggal :

Nomor Sampel :

DAFTAR TILIK

NO.	Kegiatan		Skor			Nilai
NO.	Kegiatan		0	1	2	Nilai
I. Menyiapkan bahan pemeriksaan
1.	Mencuci tangan dan menggunakan sarung tangan
2.	Menyiapkan biakan bakteri dan alat-alat yang digunakan
II. Melakukan uji sensitivitas bakteri metode difusi
1.	Membuat suspensi bakteri dengan menginokulasikan isolat pada media nutrient cair dan menginkubasi pada suhu 37⁰C selama 4-6 jam. Kekeruhan suspense biakan dibuat setara dengan standart
2.	Mencairkan media Muller Hinton Agar dalam waterbath lalu menuang dalam cawan petri steril dan membiarkan padat dalam lempeng agar dengan ketebalan 4-5 mm
3.	Menginokulasi suspensi biakan secara perataan pada permukaan lempeng agar menggunakan kapas lidi steril
4.	Menginkubasi sebentar kira-kira 10 menit agar biakan terdifusi ke dalam media
5.	Memberi disk yang berisi agensia kimia pada permukaan lempeng agar tersebut menggunakan pinset steril. Mengatur jarak masing-masing disk kira-kira 15 mm
6.	Menginkubasilempeng agar tersebut pada suhu 37 ⁰C selama 24 ja
7.	Mengamati dan mengukur diameter (zona) hambatan di sekitar disk. Tentukan zona hambatan tersebut yang termasuk resistant (R), atau intermediet (I), atau sensitive /susceptible (S) dengan dirujuk pada tabel.
8.	Membereskan alat dan bahan, melepas sarung tangan dan mencuci tangan
TOTAL NILAI

Keterangan Skor : 0 : tidak dilakukan 1 : dilakukan, tetapi tidak sempurna 2 : dilakukan dengan sempurna Petunjuk Penilaian : 1. Isilah kolom Skor dengan memberi tanda checklist (√) 2. Isilah besarnya skor yang diperoleh praktikan (0,1, atau 2) pada kolom Nilai sesuai dengan skor yang diberi tanda checklist (√) 3. Jumlahkan nilai tersebut pada kolom TOTAL NILAI
RUMUS NILAI :
Komentar Instruktur :
		Tangerang, …………………………………………….. Dosen/Instruktur, __________________________________

HASIL PENGAMATAN PRAKTIKUM

Hari Pertama:

Hari Kedua:

Kesimpulan:

Diskusi:

Nilai Praktikum

Pembimbing Praktikum

(__________________________)

Praktikan

(__________________________)

TABEL PENILAIAN DAFTAR TILIK

Kelengkapan Alat dan Bahan :

- Paper disc atau potongan kertas saring diameter 0,6 cm

- Cotton buds/ Kapas lidi steril

- Pinset

- Beaker glass

- Gelas ukur

- Inkubator

- Penggaris

- Cawan petri steril

- Suspensi bakteri (biakan murni)

- Media Muller Hinton Agar

- Aquadest steril

- Desinfektan

- Beberapa macam antibiotika konsentrasi 500 mg/10 ml = 50 mg/ml

- Media nutrient cair

Menyiapkan bahan pemeriksaan

Mencuci tangan dan menggunakan sarung tangan

Skor 0 : Tidak mencuci tangan dan menggunakan sarung tangan

Skor 1 : Hanya mencuci tangan atau menggunakan sarung tangan

Skor 2 : Mencuci tangan dan menggunakan sarung tangan

Menyiapkan biakan bakteri dan alat-alat yang digunakan

Skor 0 : Tidak menyiapkan biakan bakteri dan alat-alat yang digunakan

Skor 1 : Menyiapkan menyiapkan biakan bakteri atau alat-alat yang digunakan saja

Skor 2 : Menyiapkan biakan bakteri dan alat-alat yang digunakan

Melakukan uji sensitivitas bakteri metode difusi

Membuat suspensi bakteri dengan menginokulasikan isolat pada media nutrient cair dan menginkubasi pada suhu 37⁰C selama 4-6 jam. Kekeruhan suspense biakan dibuat setara dengan standart

Skor 0 : Tidak membuat suspensi bakteri dengan menginokulasikan isolat pada media nutrient cair dan menginkubasi pada suhu 37⁰C selama 4-6 jam. Kekeruhan suspense biakan dibuat setara dengan standart

Skor 1 : Membuat suspensi bakteri dengan menginokulasikan isolat pada media nutrient cair dan menginkubasi pada suhu 37⁰C selama 4-6 jam. Kekeruhan suspense biakan tidak setara dengan standart

Skor 2 : Membuat suspensi bakteri dengan menginokulasikan isolat pada media nutrient cair dan menginkubasi pada suhu 37⁰C selama 4-6 jam. Kekeruhan suspense biakan dibuat setara dengan standart

Mencairkan media Muller Hinton Agar dalam waterbath lalu menuang dalam cawan petri steril dan membiarkan padat dalam lempeng agar dengan ketebalan 4-5 mm

Skor 0 : Tidak mencairkan media Muller Hinton Agar dalam waterbath lalu menuang dalam cawan petri steril dan membiarkan padat dalam lempeng agar dengan ketebalan 4-5 mm

Skor 1 : Mencairkan media Muller Hinton Agar tidak dalam waterbath lalu menuang dalam cawan petri steril dan membiarkan padat dalam lempeng agar dengan ketebalan 4-5 mm

Skor 2 : Mencairkan media Muller Hinton Agar dalam waterbath lalu menuang dalam cawan petri steril dan membiarkan padat dalam lempeng agar dengan ketebalan 4-5 mm

Menginokulasi suspensi biakan secara perataan pada permukaan lempeng agar menggunakan kapas lidi steril

Skor 0 : Tidak menginokulasi suspensi biakan secara perataan pada permukaan lempeng agar menggunakan kapas lidi steril

Skor 1 : Menginokulasi suspensi biakan secara perataan pada permukaan lempeng agar menggunakan tanpa menggunakan kapas lidi steril

Skor 2 : Menginokulasi suspensi biakan secara perataan pada permukaan lempeng agar menggunakan kapas lidi steril

Menginkubasi sebentar kira-kira 10 menit agar biakan terdifusi ke dalam media

Skor 0 : Tidak menginkubasi sebentar kira-kira 10 menit agar biakan terdifusi ke dalam media

Skor 1 : Menginkubasi lebih dari 10 menit agar biakan terdifusi ke dalam media

Skor 2 : Menginkubasi sebentar kira-kira 10 menit agar biakan terdifusi ke dalam media

Memberi disk yang berisi agensia kimia pada permukaan lempeng agar tersebut menggunakan pinset steril. Mengatur jarak masing-masing disk kira-kira 15 mm

Skor 0 : Tidak memberi disk yang berisi agensia kimia pada permukaan lempeng agar tersebut menggunakan pinset steril. Mengatur jarak masing-masing disk kira-kira 15 mm

Skor 1 : Memberi disk yang berisi agensia kimia pada permukaan lempeng agar tersebut menggunakan pinset steril. Tetapi tidak mengatur jarak masing-masing disk kira-kira 15 mm

Skor 2 : Memberi disk yang berisi agensia kimia pada permukaan lempeng agar tersebut menggunakan pinset steril. Mengatur jarak masing-masing disk kira-kira 15 mm

Menginkubasi lempeng agar tersebut pada suhu 37 ⁰C selama 24 jam

Skor 0 : Tidak menginkubasi lempeng agar tersebut pada suhu 37 ⁰C selama 24 jam

Skor 1 : Menginkubasi lempeng agar tersebut pada suhu kurang dari 37 ⁰C selama 24 jam

Skor 2 : Menginkubasi lempeng agar tersebut pada suhu 37 ⁰C selama 24 jam

Mengamati dan mengukur diameter (zona) hambatan di sekitar disk. Tentukan zona hambatan tersebut yang termasuk resistant (R), atau intermediet (I), atau sensitive /susceptible (S) dengan dirujuk pada tabel.

Skor 0 : Tidak mengamati dan mengukur diameter (zona) hambatan di sekitar disk.

Skor 1 : Mengamati saja atau mengukur diameter (zona) hambatan di sekitar disk.

Skor 2 : Mengamati dan mengukur diameter (zona) hambatan di sekitar disk.

Membereskan alat dan bahan, melepas sarung tangan dan mencuci tangan

Skor 0 : Tidak melakukan 3 kegiatan tersebut

Skor 1 : Melakukan hanya 2 di antara 3 kegiatan tersebut

Skor 2 : Melakukan semua 3 kegiatan tersebut dengan benar

Tangerang, ……………………………………………..

Dosen/Instruktur,

__________________________________

B. Uji Sensitivitas Bakteri Metode Dilusi

Prinsip Kerja

Setiap agensia kimia terutama antibiotik mempunyai mekanisme atau daya hambat dan atau daya bunuh yang berbeda pada kadar tertentu terhadap suatu mikrob. Metode pengenceran konsentrasi

Bahan Pemeriksaan

Biakan bakteri murni/biakan standard

Isolat dari sampel (missal sputum, urin, pus, feses)

Alat dan Bahan

Tabung reaksi besar dan kecil

Rak tabung

Cawan petri

Pipet ukur

Syringe

Labu ukur 100 ml

Ose

Bunsen burner

Inkubator

Sediaan uji

Berbagai suspensi bakteri Gram positif maupun Gram negatif

Nutrient Broth (NB)

Nutrient Agar (NA)

Pelarut sediaan uji

Air suling

Pengencer antibiotic LDF

Antibiotic kloramfenikol

Media BHI atau Muller Hinton Broth

Media BSA atau Bismuth Sulfit Agar

Cara kerja

PENENTUAN KHM

1. Ambil 10 tabung reaksi diberi label 1-10

2. Tambahkan 1 ml LDF pada tabung reaksi no.2-9

3. Tambahkan 2 ml antibiotik kloramphenicol pada tabung reaksi no.1 dan 1 ml pada tabung no. 2 dan no.3 setelah itu tabung reaksi no.2 & no.3 dihomogenkan dengan cara ditepuk-tepuk minimal 25 kali.

4. No.3 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.4

5. No.4 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.5

6. No.5 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.6

7. No.6 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.7

8. No.7 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.8

9. No.8 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.9

10. No.9 dihomogenkan diambil 1 ml lalu buang

11. Tambahkan 1 ml suspensi Salmonella typosa pada tabung reaksi no.2-9 dan 2 ml pada tabung reaksi no.10

12. Ikat dan bungkus dengan koran lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ⁰C

13. Setelah 24 jam kemudian lihat masing-masing tabung reaksi, lalu amati kejernihan pada tabung untuk menentukan KHM. (Tabung jernih dengan no. Terakhir menunjukan konsentrasi KHM)

PENENTUAN KBM

1. Bagi daerah cawan petri steril menjadi sejumlah tabung yang jernih.

2. Inokulasikan masing masing bakteri pada tabung jernih dalam cawan petri dengan perataan menggunakan ose steril, bungkus dengan kertas koran.

3. Inkubasi cawan petri pada suhu 37⁰C selama 24 jam.

4. Amati daerah cawan petri yang membentuk koloni bakteri untuk menentukan KBM. (Daerah dengan no. terakhir yang tidak ditumbuhi koloni bakteri digunakan untuk menentukan konsentrasi KBM)

TABEL KONSENTRASI

No	Antibiotik	Pengencer	Konsentrasi (μg/ml)
1	2ml kadar 200 μg/ml	-	Kontrol negatif
2	1ml kadar 200 μg/ml	-	200
3	1ml kadar 200 μg/ml	1ml	100
4	1ml dari tabung III	1ml	50
5	1ml dari tabung IV	1ml	25
6	1ml dari tabung V	1ml	12,5
7	1ml dari tabung VI	1ml	6,25
8	1ml dari tabung VII	1ml	3,125
9	1ml dari tabung VIII	1ml	1,5625
10	1ml dari tabung IX	-	Kontrol positif